文牛胚胎移植技术操作规程
摘要：牛胚胎移植技术，已开始应用于牛的改良和品种引进中，是养牛业今后必须采用的一项新技术之一。
关键词：牛;胚胎移植;规程
中国分类号：S814.6 文献标识码：C 文章编号：1003-7950(2002)06-0044-02
牛的胚胎移植，在操作过程中技术要求高，通过我县牛胚胎移植技术的推广，现将牛胚胎移植技术操作规程介绍如下，供参考。
1 主题内容与适用范围
1.1 本规程规定了牛胚胎移植技术操作的基本原则、要求和方法。
1.2 本规程适用于牛胚胎移植技术推广应用的规范化操作。
1.3 本规程应用冻胚进行牛胚胎移植。
2 受体牛的选择标准
2.1 年龄在3～8岁，健康，无疾病，体格较大，膘度好。
2.2 繁殖性能正常，产后60d以上，并有两次以上的正常自然发情记录。
2.3 泌乳性能好，无难产史，不使用两次人工受精未孕的牛。
3 受体牛的饲养管理
3.1 做到精心管理，合理饲养，环境清洁，饲草、饲料、饮水要新鲜，补充食盐和必要的添加剂。
3.2 组成一定数量的牛群。圈舍内防止过挤，以便于发情观察。
3.3 农户长期舍饲的母牛要注意加强运动。
3.4 防止在移植前后因饲料及环境改善造成的应激反应。
4 受体牛的同期发情
4.1 使用前列腺素(PGF2α)一次肌注，诱导发情。给处于情期8～15d且直肠检查黄体的受体牛一次注射PGF2α。
4.2 两次PGF2α处理。在不考虑发情周期的情况下，可间隔11d,前后两次肌注PGF2α。
5 发情观察
原则上根据母牛接受爬跨确认为发情、早、晚各观察30min发清情况。对发情牛需做直肠检查，以确认卵泡，次日上午或晚上做直肠检查确定是否排政若在发情后36h以后排卵的牛不能用作受体牛。
6 冷冻胚胎的解冻
6.1 三步平衡法冻胚的解冻
6.1 解冻液的配备：将10%、6%和3%的PBS(培养液)保存液，用0.22/m滤器灭菌，分装在小培养皿内，第1杯为含10%的PBS保存液，第2杯为含6%的PBS保存液，第3杯为含3%的PBS保存液，第4杯为不含的PBS保存液。
6.1.2 胚胎的解冻：胚胎从液氮中取出在3s内投入38℃水浴浸10s。
6.1.3 三步脱：用70%酒精棉球消毒解冻后塑料吸管和剪刀刀刃，剪去棉塞端，与带有空气的1ml注射器连接上。再剪去吸管的另一端，在室温下将胚胎推入10%和0.3mol/L蔗糖PBS保存液中，放置5min，以后陆续移入6%和3%蔗糖的PBS保存液中，各放置5min，最后移至不含的PBS保存液中镜检待用。
6.2 一步吸管法解冻
6.2.1 解冻方法：从液氮中取出装有胚胎的塑料吸管，投入37～38℃温水中，水浴10s。
6.2.2 脱：手提塑料吸管、棉塞向下甩2～3次，将气泡甩向棉塞端，使蔗糖液和保存液混合。或者用手指轻弹气泡，使两种液体混合，将棉塞向下直立10min。
6.2.3 观察胚胎：用特制塑料吸管观察镜或显微镜的目镜，通过塑料管壁从上到下转动观察胚胎的形态和位置，确定后用70%酒精棉球消毒并切除吸管上层Icm，切口要平整，可直接用于移植。
7 胚胎的鉴定
7.1 在100～200倍实体解剖显微镜下观察受精卵的形态、色调、球的大小、均匀度、细胞的密度、与透明带的间隙以及变性情况等。
7.2 凡卵子的卵黄未形成球及细胞团的，均列为未受精卵。
7.3 胚胎的发育阶段：通常受精后6～8d非手术回收的正常受精卵发育情况如下。
7.3.1 桑椹胚一发情后第5～6d回收的卵，只能观察到球状的细胞团，分不清球，占据透明带内腔的大部分。
7.3.2 致密桑椹胚一发情后第6～7d回收的卵，细胞团变小，占透明带内腔60%～70%。
7.3.3 早期囊胚一发情后7～8d回收的卵，细胞的一部分出现发亮的胚泡腔。细胞团占透明带内腔70%～80%，难以分清内细胞团和滋养层。
7.3.4 囊胚一发情后第7～8d回收，内细胞团和滋养层界线清晰，胚泡胜明显，细胞充满透明带内脏。
7.3.5 扩大囊胚一发情后第8～9d回收，胚泡腔明显扩大，体积增大到原来的1.2～1.5倍，与透明带之间无空隙，透明带变薄，相当于正常厚度的1/3。
7.3.6 孵育胚—一般在发情后9～11d回收的受精卵，由于胚泡腔继续扩张，致使透明带破裂，卵细胞脱出。
7.3.7 凡在发情后6～8d回收的16细胞以下的受精卵均应列为非正常发育卵，不能用于移植。
8 胚胎分级
8.1 A级一胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，球大小均匀，结构紧凑，色调和透明带适中，无附着的细胞和液泡。
8.2 B级一轮廓清晰，色调和细胞密度良好，可见到一些附着的细胞和液泡，变性细胞约占10%～30%。
8.3 C级一轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞或液泡较多，变性细胞达30%～50%。
8.4 胚胎的等级划分还应考虑到受精卵的发育程度。发情后第7～8d回收的受精卵在正常发育时应处于致密桑植胚至囊胚阶段。凡在16细胞以下的受精卵及变性细胞超过1/2的胚胎均属等外。
9 移植
9.1 待移植受体牛检查 要求受体牛发情时直肠检查的卵泡直径在10～20mm左右，发情后36h出现排卵。移植前直检黄体，其直径在11～15mm以上，黄体的手感性好，质地软而充实。
9.2 受体牛的准备 将受体牛保定，清除粪便，肌注2%静松灵1ml或用2%的普鲁卡因3ml在l～2尾椎间硬膜外。清洗外阴，用高锰酸钾水冲洗消毒，用灭菌纸擦干，最后经酒精棉球消毒。
9.3 器械准备 仿西德式金属移植器，先将移植枪、抢头及金属保护外套分别用纸包扎好，高压消毒。塑料卡苏式移植枪需经气体灭菌。移植时先用70%酒精棉球消毒装有胚胎的塑料吸管，然后剪掉封口一端，装入移植枪内，套上保护外套。
9.4 移植前胚胎装管 胚胎移植时可用0.25ml吸管分三段吸入PBS保存液，中间由两个气泡隔开，中段含有胚胎。也可用小汽泡分成多段装管，胚胎在中段。一步吸管法解冻脱后，用酒精棉球多次消毒吸管，剪去封口即可用于移植。
9.5 移植 术者用左手扒开外阴，右手持移植器插入，然后左手伸进直肠，移植器到达子宫颈口时，右手用力将移植枪捅破外套填片，插入子宫颈。左手在直肠内诱导使枪头轻轻稳妥地插入黄体例子宫角至大弯处，持移植器的右手推出胚胎，缓慢旋转地抽出移植枪。
10 妊娠诊断
10.1 直肠检查法 通常在移植后3个月开始检查。妊娠90d时，子宫继续增大，落入腹腔，可感觉到胎儿的浮动，孕角出现孕脉，子宫壁可触到子叶。
10.2 诊断(B超)对妊娠25d以上的受体牛可用B超检查。
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